蛋白质分子量的测定是生命科学研究中的基本实验步骤，对于蛋白质结构分析、表达水平评估和纯度检测具有重要意义。其中，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 是最常用的方法之一，以其高效、经济和可重复性强的特点广泛应用于蛋白质研究。本文将介绍 SDS-PAGE 的技术原理、实验流程、应用场景、优势及局限性，并探讨其在蛋白质分子量测定中的重要作用。

一、SDS-PAGE 的技术原理

SDS-PAGE 的核心原理是基于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率来推测其分子量。该方法利用SDS（十二烷基硫酸钠，Sodium Dodecyl Sulfate） 将蛋白质变性，使其仅根据分子量而非电荷进行分离。

1、 SDS 在蛋白质分离中的作用

（1）SDS 是一种强阴离子去污剂，能够与蛋白质的疏水区结合，使蛋白质完全变性并形成线性多肽链。

（2）由于 SDS 赋予蛋白质均一的负电荷，因此在电场作用下，所有蛋白质仅根据其分子量大小进行迁移。

2、 聚丙烯酰胺凝胶的分离机制

（1）凝胶浓度调控分离范围：聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于单体（丙烯酰胺）和交联剂（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）的比例。低浓度凝胶适用于大分子蛋白分离，而高浓度凝胶适用于小分子蛋白分离。

（2）蛋白质迁移与分子量关系：较小的蛋白质能更容易穿透凝胶孔隙，因此分子量小的蛋白迁移得更远，而分子量大的蛋白移动较慢。

3、 迁移率与分子量的对数关系

蛋白质在 SDS-PAGE 中的迁移率（Rf 值）与其分子量的对数呈负相关，即：

log(MW)=a−b×Rf

其中 MW 为蛋白分子量，Rf 为迁移率。因此，通过测定标准蛋白的 Rf 值，可以绘制标准曲线，从而估算未知蛋白的分子量。

二、SDS-PAGE蛋白质分子量测定的实验流程

1、 凝胶制备

（1）分离凝胶（Resolving Gel）：主要用于分离蛋白质，浓度通常为 6%-15%，根据蛋白质分子量大小选择适当的浓度。

（2）浓缩凝胶（Stacking Gel）：浓度较低（通常为 4%-5%），用于提高分辨率，使蛋白质在进入分离凝胶前聚集成窄条带。

2、 样品处理

蛋白质样品需与SDS 变性缓冲液（含 β-巯基乙醇或 DTT）混合，在 95°C 加热 5-10 分钟，使蛋白质完全变性并形成均匀的负电荷。

3、 电泳

在缓冲液（Tris-Glycine-SDS）中，以恒压或恒流进行电泳，一般 100-200V 运行 1-2 小时，直到指示染料（如溴酚蓝）到达凝胶底部。

4、 蛋白质染色

（1）考马斯亮蓝染色（Coomassie Brilliant Blue Staining）：常用染色方法，灵敏度约为 50-100 ng。

（2）银染（Silver Staining）：高灵敏度，可检测到 1 ng 级别的蛋白质。

（3）荧光染料（如 SYPRO Ruby、CyDye）：适用于定量分析和高灵敏度检测。

5、 分子量计算

通过与标准蛋白 Marker 进行对比，利用标准曲线估算未知蛋白的分子量。

三、SDS-PAGE 在蛋白质分子量测定中的应用

1、 确定蛋白质的分子量

（1）通过 SDS-PAGE 可估算未知蛋白的表观分子量，用于初步鉴定。

（2）在蛋白质纯化后，利用 SDS-PAGE 可确认目标蛋白是否为预期分子量。

2、 评估蛋白纯度

用于检测蛋白纯化过程中的杂质蛋白条带，以确保目标蛋白的纯度符合实验要求。

3、 监测蛋白表达

在重组蛋白表达实验中，SDS-PAGE 可用于比较不同诱导条件下蛋白的表达水平，评估表达系统的优化情况。

4、 检测蛋白翻译后修饰

由于翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）会影响蛋白的分子量，SDS-PAGE 可用于观察蛋白迁移率变化，提示可能的修饰发生。

四、SDS-PAGE蛋白质分子量测定的优势及局限性

1、 SDS-PAGE 的优势

（1）操作简单，实验流程易于掌握，设备成本较低。

（2）适用范围广，可检测大多数蛋白质，适用于生物医药、蛋白组学等领域。

（3）重复性好，电泳结果具有较高的稳定性，适合日常实验室检测。

（4）分辨率较高，能够清晰区分 5-250 kDa 范围内的蛋白质。

2、 SDS-PAGE 的局限性

（1）分子量测定的精度有限：SDS-PAGE 只能提供蛋白质的“表观分子量”，受翻译后修饰和蛋白结构影响。

（2）无法识别蛋白序列：SDS-PAGE 只能分离蛋白，不能提供蛋白氨基酸序列信息，需要结合质谱（MS）或蛋白质印迹（Western Blot）进行鉴定。

（3）低丰度蛋白检测灵敏度较低：考马斯亮蓝染色检测下限较高，需要使用银染或荧光染色提高灵敏度。

（4）难以分辨相似分子量蛋白：如果两种蛋白质的分子量非常接近，可能无法实现清晰区分，需要更高分辨率的方法（如 2D-PAGE）。

SDS-PAGE 作为蛋白质分子量测定的经典方法，凭借其操作简便、成本低、重复性好的优势，在生物研究和药物开发中仍然占据重要地位。尽管其在高精度分子量测定和翻译后修饰分析方面存在一定局限，但与Western Blot、LC-MS 等方法结合使用，可以更全面地解析蛋白质的分子特性。凭借专业的技术团队和7大质量控制检测平台，百泰派克生物科技为从事蛋白质组学研究的科研人员提供高质量基于SDS-PAGE的蛋白质分子量测定服务，获得广泛认可。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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